晚期氧化蛋白产品是蛋白质在氧化应激环境下,被髓过氧化物酶(MPO)催化产生的活性氯(如次氯酸HOCl)氧化润饰后的终末产品。其中心结构特征是二酪氨酸交联和羰基化蛋白。这种润饰不可逆地改动了蛋白质的理化性质与生物学功用。AOPP在血浆或安排中的累积水平,直接反映了机体氧化损害的严峻程度,是心血管疾病、糖尿病肾病、缓慢炎症等病理进程的要害生物标志物。
现在临床与科研中广泛选用的分光光度法测定AOPP,其中心根据是特定波长下的吸光度改动
样本中的AOPP在酸性环境(一般运用醋酸)中,与氧化剂氯胺T(模仿体内HOCl氧化)在特定条件下反响。
运用分光光度计丈量反响混合物在340 nm处的吸光度值。该吸光度值与样本中AOPP的浓度呈正相关。通过树立规范曲线(一般运用氯胺T浓度梯度模仿AOPP水平),即可将样本吸光度值换算为对应的AOPP浓度(一般以μmol/L chloramine-T equivalents表明)。
除分光光度法外,根据单克隆抗体的酶联免疫吸附实验(ELISA)也逐步使用于AOPP检测。
运用针对AOPP特异性结构表位(如二酪氨酸)开发的高亲和力单克隆抗体。
参加酶符号(如辣根过氧化物酶HRP)的二抗,与结合的AOPP构成“抗体-AOPP-酶标二抗”复合物。参加底物(如TMB)后,酶催化底物产生显色反响。
显色强度与结合的AOPP量成正比,通过丈量特定波长(如450 nm)的吸光度,参照规范品曲线进行定量。此办法特异性更高,能更好地区别不同氧化润饰程度的蛋白。
中心组件,将入射的复合白光别离出特定波长的单色光(如检测AOPP-I₃⁻复合物所需的340 nm光)。光栅或棱镜是完成分光的要害元件,其精度直接影响波长挑选的准确性。
光电倍增管(PMT)或光电二极管阵列(PDA),将透射过样品的光信号转换为电信号。
将检测器输出的电信号扩大、处理,终究显现为吸光度值(A)或透光率(%T)。仪器的波长准确性、光路稳定性、检测器灵敏度是确保AOPP吸光度读数牢靠的根底。
有必要运用EDTA或肝素抗凝血浆,防止溶血(血红蛋白在340 nm邻近有强吸收)。血清因凝血进程或许引进额定氧化润饰,一般不作为首选样本。样本需及时别离并-80°C冻存,防止重复冻融导致蛋白降解或氧化状况改动。
氯胺T溶液需新鲜制造并避光保存,其浓度直接影响规范曲线树立和显色反响功率。醋酸浓度、KI纯度及溶解性均需严厉控制。
有必要设置严厉的空白对照(包含除样本外的一切试剂),并在340 nm处丈量其吸光度。样本的终究AOPP吸光度值需扣除空白对照值,以消除试剂自身及非特异性反响的影响。
严峻脂血样本会散射光线,导致吸光度假性升高。高速离心去除脂质或运用脂质铲除试剂是必要的预处理过程。了解光散射对吸光度丈量的影响是处理此问题的要害。
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